Некоторые основные сведения о ферментах

Несколько другие кинетические закономерности следует учитывать при определении тех веществ, которые являются эффекторами ферментов.

Для контроля начальной скорости ферментативного процесса или концентрации продукта реакции могут быть использованы практически любые доступные исследователю физико-химические методы. Наиболее часто применяют фотометрические методы индикации. При этом в качестве индикаторных часто используют, например, катализируемые пероксидазой и другими оксидазами (ферментами, катализирующими окислительно-восстановительные реакции), а также гидролазами (катализирующими реакции гидролиза) реакции образования окрашенных продуктов. Исключительно высокой чувствительностью отличаются хемилюминесцентные методы, позволяющие контролировать скорость ферментативных реакций с участием, например, люциферазы. Различные электрохимические методы (потенциометрия, амперометрия) наиболее удобны для контроля скорости реакций, протекающих с поглощением или выделением протонов, а также окислительно-восстановительных процессов, сопровождающихся поглощением кислорода, образованием НОи т.д. Ферментные электроды, в которых фермент механически или ковалентно включают в полупроницаемую полимерную мембрану, покрывающую электрод, позволяют специфически определять различные органические и неорганические соединения без введения в анализируемый раствор дополнительных реагентов.

К настоящему времени разработано большое число высокочувствительных и селективных ферментативных методов определения субстратов и эффекторов ферментов: неорганических (ионов металлов, анионов) и органических (N-, S-, P-, O-содержащих) соединений. При этом можно выделить ферменты, позволяющие определять целый класс соединений, либо часть этого класса, либо индивидуальное соединение. Так, с помощью алкогольдегидрогеназы можно определять спирты (субстраты этого фермента), алкогольоксидазы - первичные спирты, арилалкогольоксидазы - ароматические первичные спирты. Следует отметить, что методы определения эффекторов, хотя и менее селективны, часто более чувствительны, чем методы определения субстратов. Так, пределы обнаружения многих органических веществ - субстратов ферментов лежат в интервале 10- 6-10- 4 М, а органических эффекторов - 10-11-10- 8 М. Кроме того, число эффекторов ферментов значительно больше, чем число их субстратов, что расширяет возможности ферментативных методов анализа.

2. 2. Определение органических соединений

Ферментативные методы определения органических соединений успешно разрабатываются и применяются в клинических и биохимических лабораториях. Именно применение ферментов дает возможность селективно определять в крови, моче, тканях и других биологических объектах малые количества таких метаболитов и физиологически активных веществ, как мочевина, мочевая кислота, аминокислоты, сахара (в частности, глюкоза), спирты, липиды, холестерин, нуклеотиды, антибиотики.

Ферментативное определение мочевины основано на реакции ее гидролиза, катализируемой ферментом уреазой. Образующиеся продукты гидролиза - ионы и можно определять электрохимически, фотометрически или флуориметрически. Групповое определение аминокислот основано на использовании таких ферментов, как L-амино- или D-аминооксидаза, которые катализируют окисление аминокислоты кислородом воздуха до кетокислоты, пероксида водорода и аммиака. Последний далее определяют электрохимически с помощью NH3-чувствительного газового электрода. Специфическое определение отдельных аминокислот возможно при применении декарбоксилаз, дегидрогеназ, лиаз, трансфераз. Для определения глюкозы используют несколько специфических ферментативных реакций, например: 1) катализируемое глюкозооксидазой окисление ее кислородом воздуха (или другими окислителями) до глюконовой кислоты и пероксида водорода; 2) ее взаимодействие с АТФ с образованием глюкозо-6-фосфата в присутствии гексокиназы. При использовании первой реакции определение глюкозы проводят либо наблюдая за уменьшением количества кислорода в растворе с помощью О2-чувствительного электрода Кларка, либо измеряя рН раствора, который изменяется вследствие образования глюконовой кислоты, либо определяя количество образовавшегося пероксида водорода. Ферментативные методы определения сахарозы и других дисахаридов основаны на использовании специфических ферментов (инвертазы, лактазы), превращающих дисахариды в моносахариды, одним из которых является глюкоза. Далее глюкозу определяют с помощью описанного выше метода. Ферментативное определение этанола основано на использовании одного из двух ферментов: алкогольоксидазы, катализирующей окисление этанола кислородом воздуха до ацетальдегида и Н2О2 , или алкогольдегидрогеназы, в присутствии которой спирт в реакции с НАД (никотинамидадениндинуклеотидом) превращается в НАД " Н2 .

Перейти на страницу: 1 2 3 4

Публикации по єкологии

Лидары и надиры в изучении атмосферы
За последние сто лет засорение окружающей среды усилилось разными выбросами. За это время в атмосферу Земли попало, по подсчетам ученых, более миллиона тонн кремния, полтора миллиона мышьяка, около миллиона тонн кобальта. Еще более было выброшено пыли, сажи, копоти, оксидов азо ...

Экология и мораль
Экологические проблемы относятся к числу глобальных проблем, требующих немедленного решения. Для решения экологической проблемы необходимо: 1. Изучение экологических закономерностей и их учет в активно-преобразовательной деятельности. 2. ...

Разделы